Thông tin chung

Nội dung

1) Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân lập thể thực khuẩn (phage) bản địa để phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy trên tôm thẻ chân trắng tại Hải Phòng

2) Cấp quản lý: Sở KH&CN Hải Phòng

3) Tổ chức chủ trì: Trung tâm Quan trắc Môi trường biển, Viện nghiên cứu Hải sản

4) Họ và tên chủ nhiệm: TS. Lê Tuấn Sơn

5) Thành viên tham gia chính:

- Nguyễn Thị Ánh

- ThS. Nguyễn Công Thành

- ThS. Trần Quang Thư

- ThS. Trương Văn Tuân

- ThS. Thái Thị Kim Thanh

- KS. Đỗ Thị Tuyết

- CN. Lưu Ngọc Thiện

- KS. Nguyễn Minh Đức

- ThS. Nguyễn Thị Tuyết Mai

- PGS.TS. Ipek Kurtboke

6) Mục tiêu của nhiệm vụ:

* Mục tiêu chung: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân lập phage bản địa để phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy trên tôm thẻ chân trắng tại Hải Phòng.

* Mục tiêu cụ thể:

- Có được 1 dòng phage bản địa có khả năng đối kháng với V. parahaemolyticus gây bệnh, trong đó có ít nhất 01 phage có khả năng diệt khuẩn tối thiểu trên 60%.

- Xây dựng được quy trình phân lập phage bản địa để phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy trên tôm thẻ chân trắng.

- Xây dựng được quy trình sản xuất phage dạng dung dịch đạt nồng độ đạt 107 PFU/ml.

7) Kết quả thực hiện:

1. Đã phân lập được vi khuẩn DK1, DK2, DK3, TC1, TC2, DK3, TN1, TN2 và TN3 tại vùng nuôi tôm của Dương Kinh, Hải An và Thuỷ Nguyên của Hải Phòng. Các chủng vi khuẩn đều sinh trưởng tốt trên đĩa thạch TCBS (môi trường phân lập đặc trưng của Vibrio spp.), TSA và Nutrient Agar. Kích cỡ của các chủng từ 0,5 x 1,66 μm đến 0,5 x 2,42 μm.

2. Đã xác định chủng DK2 và TC1 gây bệnh cho tôm bằng phương pháp tiêm với tỷ lệ tôm chết cộng dồn là 53,3 - 60,1% sau 48 giờ. Tôm chết tại lô tiêm với TC1 và DK2 được gửi Chi cục Thú y vùng II để kiểm định và đã xác nhận: DK2 và TC1 là vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tuỵ.

3. Đề tài đã sử dụng phương pháp tách chiết DNA tổng số có hiệu chỉnh. Kết quả tách chiết DNA của vi khuẩn DK1, DK2, TC1, TC2, TN1 và TN2 đạt tỷ lệ OD260/OD280 = 1,9 - 2,1, với nồng độ DNA từ 48 - 1392 ng/uL. Điều này chứng tỏ DNA tổng số tách chiết được là sạch, rất ít đứt gãy, đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả định danh 16s rDNA chỉ ra, DK2 là vi khuẩn V. parahaemolyticus (tỷ lệ tương đồng 99,86%) và TC1 là vi khuẩn V. azureus (tỷ lệ tương đồng 100%). V. azureus TC1 gây bệnh hoại tử gan tuỵ là phát hiện mới.

4. Sử dụng 22 mẫu nước tại khu nuôi Hải Phòng để tiến hành phân lập chủng thể thực khuẩn bản địa. Đề tài đã tiến hành phân lập được 05 thể thực khuẩn (phage): phage 2, phage 2-2, phage 3, phage 2-1 và phage mix.

5. Đã xác định được phage 2 và phage 3 có khả năng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tuỵ V. parahaemolyticus DK2 và V. azureus TC1.

6. Kết quả điện di của đề tài cho thấy kích thước bộ gen của phage 2, phage 2-2, phage 3, phage 2-1 và phage mix đều lớn hơn 25 kb và các phage đều bị phân hủy hoàn toàn bởi DNase I nhưng không bị tác động bởi RNase A hoặc Mung bean nuclease chứng tỏ vật liệu di truyền của các phage khảo sát là DNA mạch đôi. Kích cỡ của thể thực khuẩn có đuôi dài 161,2 - 208,3 nm và rộng 15,5 - 25,9 nm. Từ kết quả DNA và kết quả hình thái, các chủng Vibrio phage đều thuộc họ Myoviridae viral family.

7. Thể thực khuẩn phage 2, phage 3, phage 2-1 và phage 2-2 được đánh giá là an toàn với tôm và an toàn với vi khuẩn khác (E.coli ATCC 25922, E. coli ATCC BAA 196, Salmonella sp., Staphilocuccus ATCC 25923, ATCC 29247 trên đĩa thạch TSA). Vi khuẩn đề kháng phage là an toàn với tôm, độc lực của vi khuẩn đề kháng phage là yếu.

8. Tỷ lệ nồng độ vi khuẩn Vibrio 5-2 có sử dụng chế phẩm/không sử dụng chế phẩm = 22,6%, tức là phage đã tiêu diệt 77,4% vi khuẩn 5-2. Tỷ lệ nồng độ vi khuẩn V. parahaemolyticus A23 - DK2 có sử dụng chế phẩm/không sử dụng chế phẩm = 19,5%, tức là phage đã tiêu diệt 80,5% vi khuẩn V. parahaemolyticus A23 - DK2 sau 7,5 giờ thí nghiệm. Không có sự khác biệt với các MOI khác nhau khi ứng dụng phương pháp cho ăn phage. Phương pháp tiêm cho hiệu quả phòng trị bệnh của phage với MOI = 10. Với tỷ lệ MOI là 1 và 0,1 thì không có hiệu quả phòng trị bệnh sau 5 ngày.

9. Môi trường TSB có nồng độ trung bình thể thực khuẩn là lớn nhất giữa ba môi trường TSB, NB và PYCa (p<0.05). Môi trường TSB được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo của đề tài trong việc nhân sinh khối thể thực khuẩn; Nhiệt độ phù hợp cho tăng sinh thể thực khuẩn cao là 30oC; Thời gian thu hoạch phage thích hợp là 5-7 giờ.

10. Nồng độ phage không thay đổi đáng kể khi bổ sung Chloroform 1% và 2% và vi khuẩn bị bất hoạt bởi Chloroform 2% ở điều kiện nhiệt độ phòng và 4oC. Chính vì vậy, sau quá trình tăng sinh, thể thực khuẩn có thể được thu bằng cách:

Cách 1: Ly tâm dịch nuôi cấy, lọc bằng màng lọc 0,22 µm để được dịch lọc thể thực khuẩn và giữ trong bình. Định lượng thể thực khuẩn bằng phương pháp cấy trang đĩa thạch.

Cách 2: Thêm 40-60 ml Chloroform (nồng độ cuối 2%) vào 2-3 lít dịch tăng sinh phage, để yên qua đêm ở 4°C. Sau đó ly tâm, gạn dịch trong vào bình 2-3 lít, thêm chloroform để được nồng độ cuối là 2%.

11. Nồng độ phage sau 5 giờ tăng sinh tại MOI 0,1 và 1 là cao hơn so với MOI 0,05. Với nghiên cứu sản xuất 200 ml và 2-3 lít phage của đề tài, đề xuất không sử dụng MOI 10 vì yêu cầu một lượng phage ban đầu quá cao và như vậy không hiệu quả.

12. Giá thành để sản xuất càng giảm khi sản xuất với lượng lớn. Nếu chỉ sản xuất 1 lít chế phẩm phage thì giá thành là 237.406 VNĐ cho 100 ml. Nếu sản xuất với lượng lớn (10 lít), giá thành cho sản xuất 100ml là 49.881 VNĐ. Hiện tại ở Việt Nam, chưa có giá thành cụ thể của chế phẩm phage trị bệnh hoại tử gan tuỵ trên tôm, nên đề tài không thể so sánh giá thành sản xuất.

13. Trên cơ sở nghiên cứu các quy trình phân lập từ các nghiên cứu trước, kết hợp các kết quả nghiên cứu của đề tài, đã có được “Quy trình phân lập phage bản địa để phòng trị Vibrio spp.”, cụ thể:  (1) Thu mẫu nước; (2) Tăng sinh mẫu bậc 1, lọc dịch 1 và lựa chọn vòng vô khuẩn; (3) Tăng sinh bậc 2 từ đốm tan và dịch lọc 2; (4) Tăng sinh bậc 3 từ đốm tan và dịch lọc 3; (5) Tăng sinh bậc 4 từ đốm tan và dịch lọc 4; (6) TEM và định danh; (7) Lưu và bảo quản chủng phage.

14. Trên cơ sở các quy trình sản xuất phage từ các nghiên cứu trước, kết hợp các kết quả nghiên cứu của đề tài, đã có được “Quy trình sản xuất phage dạng dung dịch đạt nồng độ 107 PFU/ml”, cụ thể: (1) Tăng sinh vi khuẩn 20mL; (2) Tăng sinh thể thực khuẩn 20mL lần 1, 2 và 3 để thu được 20mL phage có nồng độ ≥107 PFU/mL; (3) Tăng sinh thể thực khuẩn 200mL để thu được 200mL phage có nồng độ ≥107 PFU/mL; (4) Tăng sinh phage 2-3L; (5) Thu hoạch phage bằng lọc 0.22um hoặc chloroform; (6) Lưu và bảo quản phage.

8) Thời gian bắt đầu - kết thúc: 12/2021 - 12/2023

9) Kinh phí thực hiện: 1.628,481 triệu đồng, trong đó kinh phí từ NSNN: 1.482,281 triệu đồng, nguồn khác: 146,2 triệu đồng