Lê Hương Thuỷ, Võ Hoài Bắc¹, Lê Thị Lan Oanh² 
 

1. MỞ ĐẦU
Thành phần chính của chất thải sau quá trình sản xuất agar là bã rong chứa cellulose, protein và khoáng chất. Việc thủy phân cellulose từ bã rong phế thải để làm thức ăn gia súc sẽ giúp động vật tiêu hóa và hấp thụ dễ dàng các protein, glucid, các nguyên tố khoáng đa vi lượng có trong bã thải agar.
Trên thế giới hiện nay các nhà khoa học đã tiến hành thử nghiệm thành công nhiều phương pháp tận dụng phế liệu rong biển bằng phương pháp thuỷ phân trong môi trường bazơ hay axit để làm thức ăn gia súc [1]. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose trong bã thải agar bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzym cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm cả về mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường [2,3]. Các chủng nấm và vi khuẩn thường tiết ra cellulase ngoại bào mạnh [4,5]. Trong công trình nghiên cứu trước đây [6], chúng tôi đã tiến hành sàng lọc được 2 chủng vi khuẩn là Bacillus subtilis (B-505) và Bacillus lichenformis (Li) có khả năng thủy phân bã agar tốt. Nghiên cứu này xin trình bày kết quả nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện sinh cellulase ngoại bào từ 2 chủng vi khuẩn trên trên môi trường lên men công nghiệp để ứng dụng cho quá trình thủy phân bã thải agar.
2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Bã thải agar: Bã thải agar được lấy từ cơ sở sản xuất agar Công ty TNHH SX & TM Hoàng Yến phường Lãm Hà, Kiến An, Hải Phòng.
Hóa chất: Carboxymethyl cellulose (CMC), DNSA, Glucose, Pepton, cao thịt, tinh bột, cao nấm men, cao malt, MgSO4, CaCl2, K2HPO4, NaHCO3, NaCl.
Các chủng vi sinh vật: Các chủng vi sinh vật B505 (Bacillus subtilis B-505) và chủng Li (Bacillus lichenformis Li) có khả năng tổng hợp cellulase được thu thập từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghệ Sinh học, trường ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐH Quốc gia Hà Nội.
Môi trường nuôi cấy:

Phương pháp thu nhận enzym ngoại bào: Cellulase ngoại bào từ các chủng vi sinh được thu bằng cách li tâm dịch lên men 7.000 vòng/phút trong 15 phút để loại tế bào, dịch nổi được thu và cất giữ -20⁰C cho các thí nghiệm tiếp theo.
Xác định hoạt tính enzym cellulase bằng khuyếch tán trên thạch: Nhỏ 0,2ml dịch enzyme ngại bào vào các đĩa thạch đục lỗ có cơ chất CMC và bột giấy, giữ ở 4⁰C trong 2h để dịch khuếch tán đều xung quanh giếng thạch. Ủ ở 30⁰C trong 36h, sau đó tráng dịch lugol trên đĩa thạch và đo vòng hoạt tính cellulase không bắt màu xung quanh giếng thạch (7).
Xác định hoạt độ của enzym cellulase: Hoạt độ enzym cellulase được định lượng bằng phương pháp xác định đầu đường khử của Miller (8).
Đánh giá sinh trưởng của vi khuẩn: Sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng cách đo mật độ quang học (OD) của dịch nuôi cấy trên máy so màu quang phổ ở bước sóng 620nm.
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn B505 và Li: tối ưu môi trường nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, pH.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ưu môi trường nuôi cấy
Để có thể sản xuất enzym ở quy mô lớn, chúng tôi tiến hành lựa chọn các nguồn cơ chất dễ kiếm, rẻ tiền. Tiến hành xác định khả năng sinh trưởng và tiết enzym cellulase ngoại bào của 2 chủng Li và B505 trên một số loại cơ chất: bột đậu tương, bột gạo, nước mắm, môi trường giàu chất khoáng (MT1’, MT2, MT2’, MT3, MT4, MT5, MT6) và so sánh với môi trường đắt tiền (MT1).
Nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng CMC 1% bổ sung cho môi trường nuôi cấy là nguồn cung cấp cacbon tốt nhất cho các chủng vi khuẩn tiết cellulase (9,10). Để cung cấp nitrogen chúng tôi sử dụng một số nguồn cung cấp như: cao nấm men, peptone, cao thịt và NH₄Cl trong các môi trường nghiên cứu (MT1-MT6). Tuy nhiên để thu nhận cellulase ở quy mô lớn thì môi trường sử dụng CMC 1%, peptone, cao thịt khá đắt. Do vậy chúng tôi sử dụng môi trường MT5 chỉ bổ sung CMC 0,2% và thay thế CMC bằng bột gạo và bột đậu tương.

Bảng 1. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 nuôi tại các môi trường khác nhau

Hình 1. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 nuôi tại các môi trường khác nhau

Bảng 2. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li nuôi cấy ở các môi trường khác nhau

Hình 2. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 nuôi tại các môi trường khác nhau

Kết quả bảng 1, hình 1 cho thấy, ở điều kiện dinh dưỡng trong môi trường MT1’ và MT5 chủng B505 có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase cao nhất. Kết quả bảng 2 và hình 2 cũng cho thấy, ở điều kiện dinh dưỡng trong môi trường MT5 chủng Li có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase cao nhất. Như vậy môi trường MT5 thành phần chủ yếu là bột tương và bột gạo chứa nhiều loại amino acid khác nhau và vi khuẩn B505 và Li có thể sử dụng chúng vừa làm nguồn cacbon vừa làm nguồn nitrogen cho sinh trưởng, đây cũng là môi trường kinh tế để có thể sản xuất cellulase ở quy mô lớn.
3.1.2. Nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Vì vậy cần tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của 2 chủng B505 và Li ở nhiệt độ 28, 30, 32, 37 và 45⁰C.
Kết quả bảng 3.3 cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho chủng B505 sinh trưởng và tiết cellulase là 30⁰C, ngược lại chủng Li lại sinh trưởng và tiết cellulase tối ưu ở nhiệt độ 45⁰C. Bakare và cộng sự cũng tìm thấy cellulase từ chủng Pseudomonas fluorescence được tiết nhiều nhất khi nuôi cấy ở nhiệt độ 35⁰C (11). Một số nghiên cứu đã chỉ ra các chủng Bacillus subtilis và Bacillus circulans tiết cellulase mạnh nhất khi nuôi cấy ở 40⁰C [12].
 

Bảng 3. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính cellulase của chủng B505 và chủng Li ở các nhiệt độ khác nhau
 

Hình 3.Vòng hoạt tính cellulase của chủng Li và B505 khi nuôi cấy trên nhiệt độ 30ºC và 45ºC

3.1.3. pH

pH cũng là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Khả năng tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 và chủng Li cũng chịu ảnh hưởng của các nồng độ pH khác nhau một cách rõ rệt, thể hiện ở bảng 4 và hình 4.
 

Bảng 4. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase của chủng B505 và chủng Li ở các pH khác nhau

Hình 4. Vòng hoạt tính cellulase của chủng B505 và chủng Li nuôi cấy ở các pH khác nhau

Kết quả ở bảng 4 cho thấy chủng B505 nuôi ở môi trường pH 7.0 tiết cellulase mạnh nhất trong khi đó chủng Li tiết cellulase mạnh nhất khi nuôi trong môi trường có pH 5.0. Một số chủng Bacillus subtilis, B. circulans, B. alcalophilus S39 và B. amy lol quefaciens C23 đều tiết cellulase cao nhất khi sinh trưởng trong môi trường có pH 7.0 (12, 13).
3.1.4. Thời gian thích hợp để hai chủng B505 và Li sinh enzyme celluase ngoại bào
Enzyme ngoại bào được các chủng vi sinh vật tiết ra trong quá trình sinh trưởng và tích lũy theo thời gian. Kết quả xác định thời gian thích hợp để thu enzyme celluase ngoại bào của hai chủng vi khuẩn trên được trình bày trên hình 5 và hình 6.

Kết quả trên hình 5 và 6 cho thấy chủng Li sau 68h nuôi cấy tiết cellulase ngoại bào mạnh nhất. Chủng B505 sau 72h nuôi cấy cho hiệu quả tiết cellulase ngoại bào mạnh nhất, tuy nhiên sau 68h nuôi cấy hoạt lực enzym cũng đạt 99%. Để giảm giá thành sản xuất enzym thì thời gian nuôi cấy chủng B505 sau 68h là hiệu quả và kinh tế nhất.
4. KẾT LUẬN
1. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng B505 (Bacillus subtilis B-505): Chủng B505 nuôi trong môi trường công nghiệp có thành phần gồm (CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH₂PO₄ 0,6g; K₂HPO₄ 1g; nước cất 1lit), trong 68h, pH 7,0 và nhiệt độ 30ºC, lắc 200v/phút.
2. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Li (Bacillus lichenformis Li): Chủng Li nuôi trong môi trường công nghiêp có thành phần gồm (CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH₄Cl 0,4g, KH₂PO₄ 0,6g; K₂HPO₄ 1g; nước cất 1lit), trong 68h, pH 5,0; nhiệt độ 45 ºC, lắc 200v/phút.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Thị Tú (2003), Nghiên cứu xử lý toàn diện phế liệu dừa nhà máy chế biến đồ hộp bằng công nghệ vi sinh. Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học trường Đại học Khoa học tự nhiên TP. Hồ Chí Minh.
2. Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 386-390.
3. Gascoigne J. and Gascoigne M.M (1960), Biological degradation of cellulose, Butterwozch and Co.Limited, London, pp 17-21.
4. Immanuel, G., R. Dhanusa, P. Prema and A. Palavesam (2006). Effect of d iffe re n t g rowth parameters on endo glucanase enzyme activity by bacteria isolated from coir retting effluents of estuarine environment. Int. J. Environ. Sci. Tech., 3(1): 25-34.
5. Fukumori, F., T. Kudo and K. Horikoshi (1985). Purification and properties of a cellulase from alkalophilic Bacillus sp. No. 1139. J. Gen. Microbiol., 131: 129-135.
6. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn ánh Tuyết, Thí nghiệm vi sinh vật học-Thí nghiệm công nghệ sinh học-T2, Nxb Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, tr 194-210.
7. Miller GL, 1959, Anal. Chem.,31:426-428.
8. Kawai, S., H. Okoshi, K. Ozaki, S. Shikata, K. Ara and S. Ito., 1988. Neutrophilic Bacillu s s t ra in, KSM-522 that produces an alkaline carboxymethyl cellulase. Agri. Biol. Chem., 52: 1425-1431.
9. Shikata, S., K. Saeki, H. Okoshi, T. Yoshimatsu, K. Ozaki, S. Kawai and S. Ito, 1990. Alkaline cellulase for laundry detergents : production by alkalophilic s t ra in s of Bacillus and some properties of crude enzymes. Agri. Biol. Chem., 52: 91-96.
10. Bakare, M.K., I.O. Adewale, A. Ajayi and O.O. Shonukan, 2005. Purification and characterization of cellulase from the wild-type and two improved mutants of Pseudomonas fluorescens. African J. o f Biotech., 4(9): 898-904.
11. Ray, A.K., A. Bairagi, K.S. Ghosh and S.K. Sen, 2007. Optimization of fermentation conditions for cellulase production by Bacil l u s su btilis CY5 and Bacillus circulans TP3 isolated from fish gut. Acta Ichthyologica ET Piscatoria, 37(1): 47-53.
12. Abou-Taleb, Khadiga A.A., Mashhoor, W.A., Nasr, 1 1 1 Sohair A.,1Sharaf, M.S. and Abdel-Azeem, Hoda H.M. Nutritional and Environmental Factors Affecting Cellulase Production by Two Strains of Cellulolytic Bacilli. Australian Journal of Bas ic and Applied Sciences , 3(3): 2429-2436, 2009.

Người phản biện: ThS. Trần Cảnh Đình

¹Viện Công nghệ sinh học
²TTCNSH phục vụ đời sống và sản xuất